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【GNB2L1基因与肝癌】高国生《中华肝脏病杂志》：基于生物信息学探讨GNB2L1基因在肝癌中的表达及其临床价值

发布时间:2024-09-09 19:13:37【篮球快讯】人次阅读

摘要引 用 本 文范玲燕, 孙春丽, 陈昱含 高国生. 基于生物信息学探讨GNB2L1基因在肝癌中的表达及其临床价值[J]. 中华肝脏病杂志, 2022, 30(9): 954-961. DOI: 10.3760/cma.j.cn

引 用 本 文 范玲燕, 孙春丽, 陈昱含 高国生. 基于生物信息学探讨GNB2L1基因在肝癌中的表达及其临床价值[J]. 中华肝脏病杂志, 2022, 30(9): 954-961. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20211014-00509. 摘要 目的 基于生物信息学数据库分析G蛋白β2亚基类似物1（GNB2L1）基因在肝癌中的表达情况，评估其在肝癌发生、发展中的作用及其与生存率的关系。 方法 基于GEPIA、UALCAN和HPA数据库分析GNB2L1在肝癌中的表达水平以及其与生存率的关系；cBioPortal数据库分析GNB2L1基因的突变情况及其对生存率的影响；LinkedOmics数据库分析GNB2L1在肝癌中的相关基因，同时进行基因本体论（GO）功能注释、京都基因与基因组百科全书通路富集分析；STRING数据库构建GNB2L1蛋白相互作用网络；TIMER数据库分析GNB2L1基因表达与肝癌免疫浸润的关系。基于mRNA测序技术分析肝癌患者和健康对照血浆血小板中GNB2L1表达的差异。组间数据比较采用独立样本t检验。 结果 GNB2L1在肝癌组织中表达水平显著升高（P<0.05），其表达与体质量、肝癌分级和分期之间均存在显著相关性（P值均<0.05）；GNB2L1低表达组的总体生存率更高（P<0.001）。GNB2L1及其相关基因可能与生物过程调节、代谢过程、蛋白结合、氧化磷酸化、JAK-STAT信号通路、Ras信号通路等相关。GNB2L1与核糖体蛋白S12、S11、L19等存在相互作用，参与了肝脏再生、内源性凋亡信号通路的正性调控等多个生物学过程。GNB2L1表达水平与肝癌中多种免疫细胞的浸润程度均有正相关（P值均<0.05），Cox回归分析结果显示GNB2L1是肝癌患者较低生存率的独立危险因素［风险比值比（95%可信区间）为1.456（1.034～2.051），P=0.031］。肝癌患者血小板中GNB2L1的表达水平显著高于健康对照组（10.40±1.36与9.58±0.51，t=2.194，P=0.037）。 结论 GNB2L1在肝癌中高表达且与生存率密切相关，GNB2L1可能是肝癌的潜在生物标志物。 正文 全球肝癌发病率和病死率居高不下［1-2］。随着高通量测序技术的发展，涌现了诸多与肝癌发生、发展、预后相关的生物标志物和关键基因，但它们均存在相应的局限性［3］，探索新的与肝癌相关的基因仍具有重要意义。G蛋白β2亚基类似物1（guanine nucleotide binding protein beta polypeptide 2-like 1，GNB2L1），又名激活的蛋白激酶C受体1，是一个3.6×104的胞质蛋白，属于色氨酸-天冬氨酸40重复序列家族，在不同物种中广泛表达，具有高度保守性［4］。GNB2L1参与了细胞迁移、病毒感染、神经发育、血管生成和癌症转移等过程［5］，且在多种人类癌症（包括肝癌）中表达异常［6-8］。但目前针对GNB2L1在肝癌的表达，特别是与预后、免疫浸润等的相关性，研究较少且不够深入和全面。在前期工作中，我们通过血小板RNA测序技术对肝癌和肝硬化患者的差异表达基因进行了分析，筛选到包括GNB2L1在内的一系列基因。本研究进一步基于生物信息学方法，深度挖掘GNB2L1在肝癌中的表达情况及其临床价值，以期为肝癌的临床预防、诊断、治疗提供循证医学根据。 资料与方法 1. GEPIA数据库分析：GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是基于TCGA和GTEx数据库中肿瘤和正常样本进行基因表达分析的在线分析网站［9］。用GEPIA数据库分析GNB2L1基因在正常人群和肝癌患者中的差异表达情况及其与肝癌患者生存率的关系。 2. UALCAN数据库分析：UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html））是一个基于TCGA数据库中相关癌症信息进行数据挖掘的在线分析网站［10］。从UALCAN数据库中整合肝癌患者和正常对照人群的临床信息，包括年龄、性别、体质量、样本类型、癌症分期、癌症分级、有无TP53突变、淋巴转移情况、组织学亚型等，比较不同组别肝癌患者GNB2L1基因的表达情况；同时评估GNB2L1高表达组和低表达组的总体生存期。 3. HPA数据库分析：人类蛋白质图谱（human protein atlas，HPA），简称HPA数据库（https：//www.proteinatlas.org/）提供了17 000多种人类蛋白质在正常和肿瘤中组织、细胞及血液内的分布情况［11］。用HPA数据库分析GNB2L1蛋白在正常肝组织和肝癌组织中的表达情况，同时评估不同分期肝癌患者GNB2L1表达水平与生存率的关系。 4. cBioPortal数据库分析：cBioPortal数据库（http：//www.cbioportal.org/）是一款功能强大的肿瘤数据库，可以快速获取多种癌症的基因组信息［12］。用该数据库分析GNB2L1在肝癌中的基因变异情况以及对预后的影响。 5. LinkedOmics数据库分析：LinkedOmics数据库（http：//www.linkedomics.org/）可以访问、分析和比较同一种肿瘤类型内和跨肿瘤类型的癌症多组学数据［13］。应用LinkedOmics数据库对GNB2L1的相关基因进行了基因本体论（gene ontology，GO）功能注释分析和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，预测GNB2L1参与肝细胞癌的生物学功能以及信号通路。 6. STRING数据库分析：STRING数据库（https：//string-db.org/）是一个搜索已知的蛋白质相互作用的在线数据库［14］。用STRING数据库分析与GNB2L1相互作用的蛋白信息，生成蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图。 7. TIMER数据库分析：TIMER数据库（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是基于RNA-Seq表达谱数据分析肿瘤组织中免疫细胞浸润情况的在线分析工具［15］。用TIMER数据库“Gene”模块分析肝癌组织中GNB2L1表达水平与免疫细胞浸润丰度的相关性；用“Survival”模块分析GNB2L1基因和免疫细胞对肝癌患者生存率的影响。 8.血小板mRNA测序分析：留取中国科学院大学宁波华美医院15例确诊肝癌患者和15例健康体检者（两组性别和年龄均有可比性）新鲜EDTA抗凝血浆样本，分离血小板并提取mRNA；经过文库构建和测序，分析差异表达的基因。所有测试和分析由丰能医药科技（上海）有限责任公司完成。 9.统计学方法：使用GraphPad Prism9.0软件进行数据处理与分析，标准化的血小板GNB2L1 mRNA以“均数±标准差（x¯±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。以双侧检验P<0.05为差异具有统计学意义。 结 果 1. GEPIA数据库分析GNB2L1基因在肝癌中的表达：GNB2L1基因在肝癌组织中的表达较正常肝组织显著增加（P<0.05，图1A），且随着肝癌分期升高GNB2L1基因表达水平上调（F=3.28，P=0.021 1，图1B）。 2. UALCAN数据库分析GNB2L1基因在不同亚组肝癌中的表达：GNB2L1基因在肝癌组织的转录本表达量表达水平显著高于正常组织［903.814（694.867～1 200.383）与507.217（460.324～570.832），P<0.001］，见图2a；与性别、年龄的相关性不大（p值均>0.05），见图2B和2C；与体质量呈现一定程度的负相关，特别是正常体质量肝癌患者显著高于肥胖者［1 015.263（750.057～1 297.881）与744.159（568.313～878.871），P<0.001］，见图2D；与肝癌TNM分期和组织学分级均呈现一定程度的正相关，尤其是肝癌3期较1期显著增加［966.619（761.273～1 354.698）与851.357（641.692～1 052.553），P=0.007］，肝癌1级［698.776（532.110～857.363）］、2级［841.706（662.22～1 019.318）］、3级［1 041.410（829.013～1 374.509）］与4级［1 371.958（1 026.411～1 890.466）］比较，逐渐升高（P值均<0.05），见图2e、2f；与淋巴结转移、tp53变异及病理分型均无相关性（p值均>0.05），见图2G、2H、2I。 3. GNB2L1蛋白在肝癌中的表达情况分析：用HPA数据库的组织图谱分析GNB2L1蛋白在肝癌组织中的表达情况，结果显示GNB2L1在正常肝组织（图3A～3C）未见表达，在肝癌细胞的细胞质和细胞膜上中度表达（图3D～3F）。 4. GNB2L1基因表达水平与肝癌患者生存率的关系：GEPIA数据库生存曲线结果显示，GNB2L1低表达组（n=182例）的总体生存率显著高于高表达组（n=182例）［logrank P=0.013；HR（high）=1.6，P（HR）=0.014］，见图4A，与UALCAN数据库的分析结论一致（图4B）。进一步使用HPA数据库分析不同分期肝癌患者GNB2L1表达水平对生存率的影响，结果显示肝癌1～2期患者GNB2L1基因高表达组（n=71例）5年生存率显著低于低表达组（n=183例）（P=0.000 4），见图4C；同样在肝癌3～4期GNB2L1基因高表达组（n=35例）5年生存率亦显著低于低表达组（n=52例）（P=0.001 4），见图4D。 5. GNB2L1基因在肝癌中的变异情况：cBioPortal数据库分析结果显示，总共1 418例肝癌组织中，14例（0.99%）发生GNB2L1基因变异。GNB2L1最容易发生基因变异的位置在L184M。而且，发生GNB2L1基因变异的肝癌患者的总体生存率较低（P=0.055 9）。 6. GNB2L1在肝癌中的相关基因及GO功能注释、KEGG通路富集分析：LinkedOmics数据库分析结果显示，肝癌中共有12 017个与GNB2L1相关基因，其中核糖体蛋白S14（ribosomal protein s14，RPS14）、RPS23、核糖体蛋白L4（ribosomal protein L4，RPL4）等5 004个基因表达上调，DDI2、KIAA1012、MAP3K2等7 013个基因表达下调。GO功能注释分析结果显示，在生物过程方面的共表达基因主要与生物过程调节、代谢过程、应激反应以及细胞增殖等有关；在细胞组成方面的共表达基因主要与细胞膜、细胞核和膜封闭腔等有关；在分子功能方面主要与蛋白、离子和核酸的结合等有关。KEGG通路富集分析结果显示，GNB2L1相关基因高度富集于生物过程调节、代谢过程、蛋白结合、氧化磷酸化、JAK-STAT与Ras信号通路等方面。 7. GNB2L1的PPI网络分析：STRING数据库分析结果显示，GNB2L1的PPI网络图共有11个节点（node）和55个边缘（edge），平均节点度（node degree）为10，相互作用的主要蛋白包括RPS12、RPS11、RPL19、RPL8、RPS16、RPL35、RPL18A、RPS3、RPS23、RPS9。这些蛋白主要参与了肝脏再生、内源性凋亡信号通路的正性调控、细胞酰胺代谢过程的正性调节等生物过程。 8. GNB2L1基因与肝癌免疫浸润细胞的相关性分析：TIMER数据库分析结果显示，GNB2L1在肝癌中的表达水平与肿瘤细胞的纯度无相关性（P=0.054），而与多种免疫细胞的浸润水平呈显著正相关（P值均<0.05），见图5A。B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞在GNB2L1基因高扩增组的浸润水平显著下调（P值均<0.05），CD4+T淋巴细胞、巨噬细胞在GNB2L1基因低扩增组的浸润水平显著下调（P值均<0.05），见图5B。Cox回归分析结果显示，GNB2L1基因、肝癌晚期、巨噬细胞和树突状细胞浸润是肝癌患者较低生存率的独立危险因素，而CD8+T淋巴细胞浸润是保护因素（表1）。 9.肝癌患者血小板中GNB2L1的表达水平：分析结果显示，肝癌患者血小板中GNB2L1的表达水平显著高于正常对照组（10.40±1.36与9.58±0.51，t=2.194，P=0.037）。 讨 论 GNB2L1是一种类似于鸟苷β的蛋白，作为参与翻译抑制的40 S核蛋白体亚单位的一个重要组成部分，也是WD重复序列家族中最著名和研究最多的成员之一［16］。多篇文献证实GNB2L1的异常表达与多种肿瘤相关，且与患者预后密切相关［6-9］。 目前，有关GNB2L1在肝癌发生、发展的作用及相关机制也有初步的探讨。Guo等［17］通过组织芯片上的免疫组织化学染色观察到GNB2L1在肝癌中高表达，提示GNB2L1可能与肝癌的发生有关。同时有报道，GNB2L1作为关键介质将O-（连接）-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化修饰（O-GlcNAcylation）与肝癌中的蛋白质翻译联系起来，GNB2L1可在丝氨酸122位上被O-GlcNAc高度修饰，有利于癌基因在肝癌细胞中的翻译，GNB2L1的O-GlcNAcylation修饰增加与肝癌的发生发展、复发密切正相关［18］。另一项研究结果表明，肝癌中G蛋白亚单位α14可通过MAPK/JNK和PI3K/AKT信号通路抑制肝癌的进展，但该过程依赖GNB2L1的存在［19］。 本研究结果表明，GNB2L1的表达水平在肝癌中显著增加，且其表达水平与肝癌分期和分级均呈现一定程度的正相关；生存曲线分析结果表明GNB2L1是肝癌较低生存率的独立危险因素，提示其有作为预测肝癌预后生物学标志物的潜力。这在证实既往结论的基础上进一步明确了GNB2L1参与肝癌的发生和发展过程。通过分析GNB2L1基因在肝癌中的变异情况，结果表明GNB2L1基因是一个高度保守的基因（肝癌中的基因变异率仅0.8%），这与文献报道一致［4］。同时，我们发现GNB2L1基因变异的肝癌患者可能导致更低的总体生存率。鉴于相关样本量较小，确切结论仍需进一步的研究。 我们还对GNB2L1在肝癌中的相关基因进行了GO功能注释和KEGG通路富集分析，结果显示GNB2L1及相关基因高度富集在生物过程调节、代谢过程、蛋白结合、氧化磷酸化、JAK-STAT与Ras信号通路等方面。Zhang等［20］发现肝癌组织中JAK2和STAT3水平明显高于癌旁组织，他们用高表达的microRNA-409阻碍JAK-STAT信号通路的传递，结果导致细胞增殖受抑，从而减缓了肝癌进展；另一项研究通过抑制剂阻断Ras信号通路，从而有效地抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭［21］，这些报道均在一定程度上契合了本研究结论。PPI网络图亦表明，与GNB2L1相互作用的主要蛋白与肝脏再生、内源性凋亡信号通路的正性调控等相关。可见，GNB2L1可能通过以上多种途径参与和影响了肝癌的发生和发展，下一步我们将以此为基础予以更深入的机制阐明。 近年来证实间质细胞、内皮细胞和浸润性免疫细胞等基质细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，免疫治疗已成为抑制肝癌进展、复发和转移的一种有希望的方法［22］；还有学者对免疫相关的预后基因构建了列线图，后者可以有效预测肝癌患者的预后［23］。本研究基于TIMER数据库发现GNB2L1基因的表达水平与多种免疫细胞的浸润均密切相关；特别是发现GNB2L1是肝癌患者较低生存率的独立危险因素。这提示GNB2L1可能通过影响免疫细胞与肝癌细胞间的相互作用而调控疾病的进展，其具体的调控机制仍需后续予以深入的探讨。 不得不提的是，我们通过对肝癌患者血小板中GNB2L1的表达进行了初步分析，结果显示其水平显著高于正常对照，这与基于上述数据库推断的结论一致，同时提示血小板中GNB2L1基因的检测有可能作为一种有价值的肝癌诊断手段，符合Thomas Wurdinger团队2015年提出的“肿瘤教育的血小板”的mRNA谱可以应用于肿瘤的诊断和治疗的观点。 综上所述，通过生物信息学分析方法挖掘多种数据库，发现GNB2L1在肝癌中高表达且与生存率密切相关，GNB2L1可能是肝癌预后的潜在生物标志物，并有望成为肝癌治疗的有效分子靶点。鉴于本研究的结论均基于既往数据库，存在一定的局限性（譬如由于组织芯片提供者所执行的标准差异较大，因此，结果的可靠性有待验证），而且GNB2L1的PPI网络复杂，具体通路还需要细胞实验或者动物实验进行验证分析，故有关GNB2L1在肝癌中的作用及其机制尚需进一步的基础实验予以验证和确认，这将是今后的研究重点。同时，本研究的结果大部分依赖于在线分析工具，因此，方法上创新性不足，下一步课题组将基于大数据的挖掘建立新的算法，尝试对GNB2L1的临床价值予以确认并推广应用。 参考文献 [1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. 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